這是一篇針對(duì)實(shí)驗(yàn)室萌新寫的關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的詳細(xì)介紹，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室老手也建議收藏轉(zhuǎn)發(fā)給師弟師妹，這樣省心省力，又能節(jié)省大量講解時(shí)間，這不香么？簡單來講，CRISPR-Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過這種技術(shù)科研人員可以對(duì)細(xì)胞和生物體內(nèi)的基因進(jìn)行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術(shù)，對(duì)生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修改。

　　這是一篇針對(duì)實(shí)驗(yàn)室萌新寫的關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的詳細(xì)介紹，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室老手也建議收藏轉(zhuǎn)發(fā)給師弟師妹，這樣省心省力，又能節(jié)省大量講解時(shí)間，這不香么？

　　人體有著一套復(fù)雜且高效的免疫系統(tǒng)，時(shí)刻保護(hù)著我們免受病毒和細(xì)菌的攻擊。但是，對(duì)于弱小又無助的原核細(xì)胞而言，它們也是急切需要被保護(hù)的。為此，經(jīng)過幾億年的進(jìn)化，細(xì)菌和大部分古細(xì)菌衍生出了CRISPR-Cas系統(tǒng)，用于保護(hù)它們免受外源DNA和噬菌體的侵染。到目前為止，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)50%的細(xì)菌和超過90%的古細(xì)菌均攜帶有CRISPR-Cas系統(tǒng)。CRISPR是一段高度重復(fù)的DNA序列，兩端重復(fù)序列之間存在著各不相同的spacer序列，表達(dá)Cas蛋白家族的基因簇位于CRISPR位點(diǎn)的上游，其表達(dá)翻譯的幾種類型的Cas蛋白作為原核生物免疫應(yīng)答的效應(yīng)器發(fā)揮著重要作用。

　　當(dāng)細(xì)菌受到噬菌體的侵染時(shí)，被釋放到細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的噬菌體基因組的某段DNA序列被識(shí)別并整合到CRISPR的spacer區(qū)域，隨后轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的crRNA前體（pre-crRNA）。crRNA前體經(jīng)過修飾和加工，生成向?qū)NA（guide-RNA）。由于gRNA中存在一段來源于噬菌體基因組的序列，因此gRNA可以通過堿基的互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別噬菌體的基因組。同時(shí)存在于細(xì)胞質(zhì)中的gRNA和Cas蛋白特異性結(jié)合，并靶向到噬菌體基因組參與DNA的切割與降解。

　　簡單來講，CRISPR-Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過這種技術(shù)科研人員可以對(duì)細(xì)胞和生物體內(nèi)的基因進(jìn)行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術(shù)，對(duì)生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修改。

　　基于原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)研發(fā)出的CRISPR-Cas9技術(shù)只包含兩種重要的成分，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，而另一種則是具有導(dǎo)向功能的sgRNA（single guide RNA）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)sgRNA和Cas9蛋白時(shí)，Cas9蛋白通過與sgRNA結(jié)合，靶向到目的DNA序列上發(fā)揮DNA雙鏈切割的功能。DNA序列被切割產(chǎn)生斷裂后，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)部的DNA修復(fù)機(jī)制（DNA repair）。真核細(xì)胞同時(shí)存在著同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。在同源重組修復(fù)下，斷裂的染色體以另一條完整的姐妹染色單體為模板進(jìn)行DNA修復(fù)，而在非同源重組修復(fù)下，斷裂出的DNA隨機(jī)修復(fù)，引入新的堿基，使基因產(chǎn)生移碼突變。

　　從很久以前，生物學(xué)家們就熱衷于一種研究策略，那就是功能缺失策略（loss of function）。常規(guī)的理解是這樣的，當(dāng)我們想要去研究某個(gè)基因在整個(gè)基因組中的作用時(shí)，只需要通過某種方法將這個(gè)基因從基因組中剔除，然后觀察去除這個(gè)基因之后，這個(gè)細(xì)胞或生物體會(huì)發(fā)生怎樣的變化，然后根據(jù)這些變化去推斷這個(gè)基因的功能?；蚯贸褪怯脕砻枋鰧⒛硞€(gè)或某些基因從基因組中剔除這件事，而基因敲除技術(shù)則是用于完成這件事的方法或技術(shù)。

　　在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，我們只需要將Cas9蛋白和設(shè)計(jì)好的gRNA同時(shí)“運(yùn)送”進(jìn)細(xì)胞中即可，接下來的就交給細(xì)胞自己去操作了。

　　1）RNP法。直接將大量的gRNA和Cas9蛋白，通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞

　　2）病毒法。構(gòu)建慢病毒（LV）敲除質(zhì)粒，經(jīng)病毒包裝和純化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將sgRNA和Cas9蛋白元件整合到細(xì)胞基因組中，從而使細(xì)胞源源不斷地生產(chǎn)sgRNA和Cas9蛋白。

　　3）常規(guī)質(zhì)粒法。構(gòu)建常規(guī)敲除質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)將其導(dǎo)入細(xì)胞，短時(shí)間內(nèi)表達(dá)gRNA和Cas9蛋白。

　　4）轉(zhuǎn)座子法（PiggyBac）。將攜帶有PB轉(zhuǎn)座子和piggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)座酶促進(jìn)轉(zhuǎn)座，將高拷貝的Cas9蛋白和gRNA表達(dá)元件隨機(jī)整合到基因組，實(shí)現(xiàn)gRNA和Cas9蛋白的持續(xù)表達(dá)。

　　這四種方法各有優(yōu)劣，我們?cè)谶x擇時(shí)可根據(jù)所研究的靶基因及靶細(xì)胞的特性，選取適合自己研究要求的方法。這期的分享就到此為止，相信看到這大家對(duì)CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)有了不錯(cuò)的理解。

　　賽業(yè)生物作為一家綜合解決方案提供商，依托于品系豐富的基因編輯小鼠資源庫、高效且智能化的模式動(dòng)物定制平臺(tái)、藥物篩選評(píng)價(jià)小鼠模型平臺(tái)、一站式小動(dòng)物表型分析平臺(tái)、一站式無菌鼠技術(shù)服務(wù)平臺(tái)及先進(jìn)的細(xì)胞技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，建立了多位一體的創(chuàng)新性CRO平臺(tái)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，以服務(wù)于腫瘤、免疫、代謝、內(nèi)分泌、心血管、神經(jīng)及傳染病等方向的科學(xué)研究及藥物研發(fā)篩選，并與全球100多個(gè)國家和地區(qū)的數(shù)萬名科學(xué)家及企事業(yè)單位建立了廣泛的合作，產(chǎn)品與技術(shù)已直接應(yīng)用于包括CNS（Cell, Nature, Science）三大期刊在內(nèi)的4800余篇學(xué)術(shù)論文。賽業(yè)生物已獲得ISO9001:2015和AAALAC雙認(rèn)證，確保向廣大專家學(xué)者提供的所有產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)符合國際標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)也表達(dá)了我們尊重動(dòng)物福利和倫理，重視生物安全的負(fù)責(zé)任態(tài)度。

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　　賽業(yè)生物扎根模式動(dòng)物定制領(lǐng)域15年，擁有多項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)新。2016年，獨(dú)創(chuàng)的TurboKnockout技術(shù)把ES打靶金標(biāo)準(zhǔn)推向新高度；同年，特殊優(yōu)化的CRISPR-Pro使大片段敲入及條件性敲除變得更加高效。賽業(yè)模式動(dòng)物研究中心在江蘇太倉（緊鄰上海）、廣州科學(xué)城核心區(qū)和河北固安（緊鄰北京）等地?fù)碛泄灿?jì)4萬平方米新動(dòng)物設(shè)施，配備有IVC飼養(yǎng)設(shè)備超過1600套，可養(yǎng)殖SPF級(jí)別大小鼠超過15萬籠，動(dòng)物種群規(guī)模超過50萬只。從健康檢測(cè)、遺傳控制到人員培訓(xùn)、個(gè)性化繁育等方面，全方位滿足您對(duì)模式動(dòng)物定制模型飼養(yǎng)繁育的要求。

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