來自荷蘭Hubrecht研究所和烏特勒支醫(yī)學(xué)中心、麻省理工學(xué)院的研究人員稱，他們開發(fā)出了一種自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技術(shù)，可以繞開基因編輯過程中所有的克隆步驟，在數(shù)小時內(nèi)完成CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因突變及位點特異性轉(zhuǎn)基因敲入。

　　來自荷蘭Hubrecht研究所和烏特勒支醫(yī)學(xué)中心（UMC Utrecht）、麻省理工學(xué)院的研究人員稱，他們開發(fā)出了一種自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技術(shù)，可以繞開基因編輯過程中所有的克隆步驟，在數(shù)小時內(nèi)完成CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因突變及位點特異性轉(zhuǎn)基因敲入。他們的研究成果發(fā)布在10月29日的《Stem Cell Reports》雜志上。

　　CRISPR序列源于原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng)，協(xié)同Cas（CRISPR-associated）蛋白家族參與抵抗噬菌體或其他病毒的二次感染，廣泛存在于細菌和古細菌中。目前已發(fā)現(xiàn)三種不同類型的CRISPR/ Cas系統(tǒng)。

　　當(dāng)前，研究人員已將II型CRISPR/ Cas系統(tǒng)CRISPR/ Cas9系統(tǒng)改造成為了一種高效的新型基因組編輯工具，它能夠以一種位點特異性方式在培養(yǎng)細胞和整個生物體中實現(xiàn)定向修飾（突變、刪除、添加、激活、抑制）特定基因序列?，F(xiàn)已在人類、小鼠、斑馬魚、酵母、細菌、果蠅，線蟲、擬南芥等物種中得到廣泛應(yīng)用。

　　在CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯中，人們設(shè)計出一條可靶向目的基因組位點的單導(dǎo)向RNA (sgRNA)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，Cas9蛋白在這條sgRNA的引導(dǎo)下完成對DNA的切割。定點誘變和靶向轉(zhuǎn)基因是發(fā)育和疾病研究中重要的手段之一，能夠輕易地編輯所有基因組位點可徹底地改變遺傳和干細胞研究。

　　目前，CRISPR/Cas9打靶要求為每個新位點克隆出一個位點特異性sgRNA質(zhì)粒，要在大約1周的時間內(nèi)完成質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化、純化和序列驗證等多個耗時且費錢的步驟。這阻礙了需要進行大規(guī)模sgRNA篩查的多重及高通量基因組編輯應(yīng)用。此外，采用CRISPR/Cas9敲入轉(zhuǎn)基因仍然需要費時地構(gòu)建通常具有600-6,000 bp同源臂的同源性載體，這一辛苦費力的過程阻礙了建立基因敲入細胞系。這些障礙抑制了大規(guī)模靶向基因組操控革命性的潛力。

　　在這篇新文章中，研究人員提出了一種替代性sgRNA和同源性載體生成新方法，其無需克隆質(zhì)粒，因此大大縮短了時間，減輕了工作量及CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因組編輯的成本，而維持了位點特異性突變和轉(zhuǎn)基因插入的高效率。

　　這種scCRISPR技術(shù)無需為每個靶位點克隆出一條位點特異性的sgRNA或基因敲入同源性載體，可在數(shù)小時內(nèi)完成CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因組突變或位點特異性的轉(zhuǎn)基因敲入。研究人員稱他們將一種自我切割的回文結(jié)構(gòu)sgRNA質(zhì)粒，和一條編碼所需位點特異性sgRNA的雙鏈DNA短序列導(dǎo)入到靶細胞中，使得它們能夠通過同源重組生成位點特異性sgRNA質(zhì)粒。每個靶位點只需2小時準(zhǔn)備時間，相比于基于質(zhì)粒構(gòu)建sgRNA，scCRISPR可以低近6倍的成本有效地實現(xiàn)基因敲除（突變率達到88%）。隨后，研究人員在小鼠和人類胚胎干細胞(ESCs)及HEK293T細胞中證實了它們的基因組編輯效率。

　　這種新方法大大簡化了生成靶向轉(zhuǎn)基因或基因敲除細胞系的過程，且不影響效率，由此為大規(guī)模基因組編輯和篩查應(yīng)用提供了一個理想的平臺。

　　Kennedy Adam Richard博士：CRISPR CAS9…開云中國 Kaiyun中國官方網(wǎng)站