技術(shù)。這個當年名聲大噪的技術(shù)，現(xiàn)今依舊熱度不減，尤其是我們的CRISPR大神張鋒，近期發(fā)表的文章頻頻亮相于知名雜志，又引起一片熱議。時過境遷，CRISPR技術(shù)并沒有銷聲匿跡，一直在線。但任何事物包括技術(shù)

　　火了四年之久的技術(shù)，耳熟能詳?shù)膬?yōu)勢顯而易見：摒棄了對于ES細胞的依賴，CRISPR技術(shù)實現(xiàn)了對大鼠、豬、猴、斑馬魚等多種物種的編輯；CRISPR技術(shù)依賴于Cas9和sgRNA實現(xiàn)“精準”切割，簡化實驗步驟，大大縮短實驗周期。周期短、工作量小，隨之而來的就是費用的降低。綜上，性價比高的技術(shù)當然當仁不讓的會一直火。

　　CRISPR技術(shù)自問世以來，被應(yīng)用至世界各地眾多實驗室中進行科學研究，在享受其優(yōu)勢的同時，它的弊端也是眾所周知：sgRNA與Cas9蛋白這哥倆，并不是時時刻刻都兢兢業(yè)業(yè)工作的，誰還沒有倦怠的時候呢？本應(yīng)該精準定位的sgRNA也有走眼的時候，本應(yīng)該識別標準PAM序列 的Cas9蛋白，也偶爾不走心，結(jié)果就是脫靶，影響了編輯的效率。

　　醫(yī)生治病講究對癥下藥，科研思路也不例外。找出原因解決問題，既然是sgRNA和Cas9蛋白出現(xiàn)了毛病，那么我們就針對不同病癥采取不同方式：

　?。?）改變自我：改變sgRNA 的長度，截斷5 端的2-3 個堿基或在識別序列前加2 個鳥嘌呤，切割活性不變， 脫靶率降低5000 倍。

　　（2）提升自我：增加sgRNA 的穩(wěn)定性。如在gRNA 中增加一對A-U 堿基配對等方法。此外， 有研究表明Cas9 直系同源酶對某些位點的特異性較SpCas9 高，這無疑為提高特異性提供了一條新思路。

　　專一性對于家庭是很重要，而對于CRISPR技術(shù)也是很重要。專一性一方面與自身有關(guān)，另一方面也與環(huán)境的誘惑有關(guān)，因此對于Cas9蛋白，我們要從內(nèi)和外兩個因素去考慮。

　?。?） 擦亮眼睛，辨認出誰是你的Mr/Mrs Right：增強Cas9 蛋白對標準PAM 序列的識別能力，突變體D1135E對標準PAM 的識別更加特異，從而降低因識別非標準PAM 序列而引起脫靶。

　　（2）與對的人相親相愛就好，不要老是沾花惹草：將Cas9蛋白進行定點突變形成eSpCas9和SpCas9-HF1，突變體減弱了Cas9 蛋白與DNA 的非特異性結(jié)合的能力，增強靶向序列與Cas9 蛋白結(jié)合的競爭力。

　?。?）減少外界誘惑：調(diào)控Cas9 蛋白在細胞中的表達量。通過使用誘導型啟動子、插入4-HT 依賴的內(nèi)含肽等方法構(gòu)建誘導型Cas9 蛋白，減少基因組暴露于Cas9 與sgRNA 復合體的時間， 即減少Cas9 與非靶向序列的結(jié)合概率，進而降低脫靶率。

　?。?）斷舍離：僅保留其核酸識別能力，斷除其核酸內(nèi)切酶的活性。當然對于自身也是必須的：降低HNH 或RuvC 結(jié)構(gòu)域功能的突變體H840A 和D10A；構(gòu)建使Cas9 蛋白喪失核酸內(nèi)切酶活性，借助其他核酸內(nèi)切酶實現(xiàn)基因編輯的CRISPRi和FokⅠ-dCas9。

　　對大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，采用ES細胞方式制備，隨機插入概率約為20%，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，大約有32%的概率有隨機插入。而這32%中有14%的隨機插入無法依靠交配傳代去除，排除隨機插入的金標準是Southern blot。百奧賽圖嚴把質(zhì)量關(guān)，堅持進行Southern blot檢測，確?；蚓庉嫬@得的動物無隨機插入。

　　Southern雜交的目的是為了檢測目的基因的插入位置及拷貝數(shù)量。Southern blot雜交是進行基因組DNA特定序列定位的方法，其操作過程：利用電泳分離經(jīng)酶消化后的DNA片段，然后再將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

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