下述5大類技術方法各有特色和適用范圍，將可能會成為在分子診斷各細分領域的主要檢測方法。

　　隨著我國常態(tài)化新冠疫情防控措施的落實落細，檢測成本較低、操作簡單、易推廣、準確度和靈敏度較高，且能滿足短時間高通量檢測的實時熒光定量PCR法在眾多檢測方法中被認可成為新冠檢測的金標準。但是隨著檢測標本量的增加，熒光定量PCR法本身的一些缺點曝露的更加明顯。

　　●不夠快：從核酸提取、試劑配制到PCR檢測的操作和銜接過程需要大量精細操作，完成一輪檢測至少需要2小時，不利于迅速得到檢測結果；

　　●檢測結果干擾因素多：如樣本種類、樣本采集方法、樣本儲存運送、干擾物質(zhì)、拭子類型、保存液類型、核酸提取試劑和熒光定量PCR儀穩(wěn)定性都會直接影響實驗結果；

　　為改善上述問題，研究者嘗試利用多種新的擴增和檢測技術，如數(shù)字PCR、電化學PCR、恒溫擴增、CRISPR、微流控等技術方法來解決上述方法之不足。

　　數(shù)字PCR (digital PCR，dPCR) 不需要標準曲線或內(nèi)參基因，在數(shù)萬個反應單元中獨立檢測目的序列，顯著降低每個反應單元中背kaiyun中國網(wǎng)頁版登錄景基因和干擾物質(zhì)的豐度，大大提高了檢測靈敏度和對特定擴增抑制劑的耐受性。

　　目前主要用于稀有突變位點檢測、拷貝數(shù)變異（CNV）檢測、NGS文庫精確定量等。 dPCR在新冠的環(huán)境樣本和臨界濃度新冠樣本檢測發(fā)揮更大的優(yōu)勢。 ? Suo, T等分別對14例新冠疑似患者和63例確診患者的臨床樣本進行dPCR和熒光定量PCR的盲樣檢測，對比結果發(fā)現(xiàn)，有26例確診患者的熒光定量PCR檢測陰性的樣本，用dPCR隨訪檢測為陽性。該文作者認為dPCR可以作為恢復期患者新冠樣本檢測結果再確認的補充手段。 現(xiàn)有的dPCR根據(jù)液體分散方式分類：微流控芯片式、自吸分液式和微滴式，其中微流控芯片是將芯片表面光刻多個腔室，通過閥門控制液體流動和分液；自吸分液式是將芯片表面進行疏水處理，微孔為親水處理，這種親疏水的方式可以將反應體系自動的分割為多個獨立反應體系。微滴式是將反應體系通過油包水技術乳化分散在大小均一的液滴反應單元中，相比以上兩種dPCR技術，微滴式dPCR儀成本更低。 已經(jīng)商業(yè)化的微流控芯片式dPCR儀主要有ThermoFisher公司Quant Studio、Fluidigm公司BioMark和Forulatrix公司Constellation系統(tǒng)。微滴式dPCR儀主要有Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列，銳訊生物公司DropX-2000、小海龜BioDigital以及法國Stilla Technologies公司Naica System。

　　電化學PCR是將PCR擴增和電化學生物傳感器檢測相結合的技術，并集成在一起，旨在提供一種快速、小型化、手持式儀器。電化學PCR中使用的電化學活性標簽（如金屬配合物、有機分子等）比熒光染料更耐用和更便宜，同時電化學法檢測所需要的成本也遠低于光學器件。 國外已經(jīng)有一些公司利用電化學PCR技術開發(fā)出相應的微流控產(chǎn)品。其中Atlas Genetics io系統(tǒng)檢測模塊就是采用電化學檢測方法，其電化學檢測的原理為：用不對稱PCR產(chǎn)生單鏈DNA，然后單鏈PCR產(chǎn)物與具有二茂鐵標簽的探針結合成雙鏈DNA。核酸外切酶消化雙鏈DNA產(chǎn)物，探針上的二茂鐵會在水解過程釋放出來，從而導致溶液中電化學性質(zhì)改變，這種改變被電化學傳感器檢測到并轉(zhuǎn)化為電信號的改變，從而到達檢測的目的。 另外，GenMark公司的ePlex采用了類似于Atlas Genetics io產(chǎn)品的電化學檢測來取代常規(guī)的熒光檢測。與Atlas Genetics io不同的是，非對稱擴增產(chǎn)生大量單鏈DNA后，單鏈DNA跟兩個探針結合。一條探針被固定在電極上，一條探針被電化學標記物標記。單鏈DNA先一端與固定探針結合，再另一端與標記的探針結合，因為標記探針靠近了電極，從而檢測到了電信號改變。 FDA最近也批準了運行在ePlex平臺的GenMark ePlex? SARS-CoV-2檢測試劑盒。

　　恒溫擴增技術 (isothermal amplification technology，IAT) 是一種在恒定溫度條件下、較短時間內(nèi)和特定酶作用下即可完成核酸擴增的技術。與PCR方法相比，恒溫擴增技術是一種快速、特殊、更簡單、更便宜的kaiyun中國網(wǎng)頁版登錄樣品核酸檢測方法。 (了解詳情， 請點擊“閱讀原文” )

　　CRISPR/Cas系統(tǒng)是由成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關基因 （Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats, CRISPR) 序列與Cas核酸酶構成，是基因組編輯的基礎，該技術在分子診斷檢測也越來越熱門。由于其高特異性，這種方法在床旁診斷中具有較大吸引力。Hou等人開發(fā)了一種名為CRISPR-covid的快速檢測SARS-CoV-2，實驗周期更短(~40min)，并同步與RT-PCR和宏基因組測序進行對比。 （了解CRISPR/Cas檢測系統(tǒng)可進入專題，閱覽原文及文章《CRISPR/Cas基因編輯技術在病原診斷中的應用》）

　　微流控芯片技術將核酸提取、擴增和檢測集成于一起，因而可擺脫專業(yè)繁瑣的操作以及對專業(yè)實驗室的依賴，從而可以由非專業(yè)人員完成操作，普及到醫(yī)院門急診、床旁檢測，甚至可以居家自測，受眾更加廣泛，臨床適應性更強。此外，由于反應過程處于封閉的環(huán)境中，可以消除交叉污染的可能性，同時也避免操作者感染的風險。由于功能集成，提高了檢測效率，因此可以在較短時間內(nèi)完成多個項目的檢測，顯著提升檢測效率。 現(xiàn)在主要的商業(yè)化微流控分子診斷產(chǎn)品包括GeneXpert全自動分子診斷平臺，F(xiàn)ilmArray全自動分子診斷平臺，Atlas Genetics io系統(tǒng)，ePlex檢測系統(tǒng)，Cobas Liat PCR 檢測系統(tǒng)，Revogene全自動化分子診斷設備以及國內(nèi)博暉創(chuàng)新的GenPlex微流控全自動核酸檢測系統(tǒng)等。 (了解各系統(tǒng)優(yōu)缺點， 請點擊“閱讀原文” )

　　上述5大類技術方法各有特色和適用范圍，將可能會成為在分子診斷各細分領域的主要檢測方法。

　　原文以《核酸擴增和檢測新技術在分子診斷中的應用》為題發(fā)表在《臨床實驗室》雜志2022年3月刊專題“POCT分子診斷”新技術與新方法版塊