多發(fā)性骨髓瘤（MM），一種血液惡性腫瘤，其特點(diǎn)是骨髓中的漿細(xì)胞發(fā)生多階段變化，導(dǎo)致多器官受損。雖然臨床上蛋白酶體抑制劑如硼替佐米（BZB）取得了一定的療效，但耐藥性問題仍然是一個(gè)主要障礙，使得MM成為一種無法治愈的疾病。先前的研究已經(jīng)逐漸揭示了非編碼基因，尤其是長非編碼RNA（lncRNA）在MM的腫瘤發(fā)生和藥物反應(yīng)性中的作用，它們不僅調(diào)控基因表達(dá)，還具有成為治療靶點(diǎn)的潛力。然而，目前對MM中大多數(shù)非編碼RNA的功能認(rèn)識(shí)仍然不足。
一、長非編碼RNA的缺失CRISPR-Cas9篩選在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中的應(yīng)用研究團(tuán)隊(duì)使用經(jīng)過驗(yàn)證的第三代慢病毒CRISPR-Cas9文庫，在多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞系A(chǔ)MO-1及其抗BZB亞克?。ˋBZB）上對671個(gè)長非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行了隱性集合CRISPR-Cas9篩選。30天轉(zhuǎn)導(dǎo)后，他們通過NGS測序技術(shù)追蹤了存活細(xì)胞中的pgRNA盒，以量化lncRNA對細(xì)胞生長的影響。篩選結(jié)果符合預(yù)期，證實(shí)了方法的有效性。在篩選中，與非靶向和對照基因相比，靶向lncRNA的pgRNA顯示出廣泛的損耗對折變化（logFC）。排除核糖體蛋白基因和其他對照基因后，研究人員確定了42個(gè)顯著減少細(xì)胞生長或誘導(dǎo)MM細(xì)胞死亡的非蛋白編碼位點(diǎn)，其中9個(gè)在兩個(gè)細(xì)胞系同存在，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，突出了這些依賴性在MM特異性和基因組背景獨(dú)立性方面的關(guān)鍵作用。
圖1 LncRNA的缺失CRISPR-Cas9篩選在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中的應(yīng)用
二、篩選結(jié)果和依賴性分析研究小組利用MAGeCK分析方法確定了對MM細(xì)胞健康有顯著影響的lncRNA，過濾掉了控制必需基因和沒有表現(xiàn)出顯著影響的非靶向lncRNA，進(jìn)一步縮小了候選基因的范圍。隨后，他們重點(diǎn)研究了在768名MM患者中基礎(chǔ)表達(dá)水平顯示出顯著預(yù)后能力的lncRNA，最終確定了8個(gè)具有潛在致癌潛力的未表征lncRNA作為多發(fā)性骨髓瘤的候選基因。該過程不僅通過基因表達(dá)分析確定了lncRNA的致癌潛力，還為后續(xù)的功能研究和臨床驗(yàn)證提供了基礎(chǔ)。對每個(gè)候選基因的表達(dá)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs在MM患者中明顯上調(diào)，與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)。通過對這些lncRNA的研究，研究人員希望能夠揭示其在MM病理過程中的具體功能。
三、篩選高優(yōu)先級的致癌 lncRNA 候選者在AMO-1和/或ABZB細(xì)胞的關(guān)鍵lncRNA中，之前未被特征化的RP11-350G8.5（別名IL6R-AS1）因其在AMO-1和ABZB中的顯著必要性和與MM患者預(yù)后的顯著相關(guān)性而成為頂級候選者。RP11-350G8.5在這些細(xì)胞系中的損耗對折變化（logFC）分別為-1.53和-2.02，MAGeCK假發(fā)現(xiàn)率（FDR）為6.5 × 10^-4和2.6 × 10^-4。此外，該lncRNA在MM患者中的上調(diào)與不良預(yù)后密切相關(guān)，暗示其在腫瘤發(fā)展中的關(guān)鍵作用。研究團(tuán)隊(duì)比較了RP11-350G8.5與其反義基因（IL-6R）的表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)明顯證據(jù)表明RP11-350G8.5對IL-6R有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。值得注意的是，IL-6R在AMO-1中不是必需基因，這進(jìn)一步表明RP11-350G8.5的致癌作用與其反義基因的調(diào)控?zé)o關(guān)。
研究人員通過qRT-PCR分析了ABZB和AMO-1細(xì)胞系中RP11-350G8.5和LINC00467的過表達(dá)情況，并將其與健康供體的外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行了比較。分析結(jié)果表明，這些lncRNA在MM細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于正常細(xì)胞，這可能暗示它們在多發(fā)性骨髓瘤（MM）的發(fā)病和發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。特別是RP11-350G8.5在MM細(xì)胞中的高表達(dá)水平可能表明其在腫瘤微環(huán)境中具有潛在的致癌特性。此外，與LINC00467相比，RP11-350G8.5的基礎(chǔ)表達(dá)水平較低，這可能表明它們在細(xì)胞過程中的不同作用。盡管當(dāng)前的研究結(jié)果充滿希望，但對這兩個(gè)lncRNA的具體作用機(jī)制和它們之間的相互作用仍需進(jìn)一步探究。這些發(fā)現(xiàn)為深入了解MM中l(wèi)ncRNA的功能，尤其是在耐藥性和細(xì)胞增殖方面，提供了新的線索。在比較硼替佐米（BZB）治療患者的表達(dá)水平的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，RP11-350G8.5在MM患者中明顯升高。這一結(jié)果表明，RP11-350G8.5在腫瘤細(xì)胞存活過程中起著關(guān)鍵作用，可能與耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。此外，LINC00467的高表達(dá)與RP11-350G8.5之間存在正相關(guān)關(guān)系，表明這兩個(gè)lncRNA可能共同影響MM的進(jìn)展。因此，針對RP11-350G8.5的靶向療法可為克服BZB耐藥性提供新策略，并為臨床治療方法提供新見解。
圖4 RP11-350G8.5的潛在致癌作用：體外驗(yàn)證及來自體內(nèi)模型的初步數(shù)據(jù)五、RP11-350G8.5和LINC00467在多發(fā)性骨髓瘤中的作用研究人員進(jìn)一步探討了RP11-350G8.5和LINC00467在多發(fā)性骨髓瘤（MM）中的功能及其相互作用。這兩個(gè)lncRNA的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的生存能力、增殖能力及對化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。特別是RP11-350G8.5的高表達(dá)與MM患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示其在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的潛在致癌作用。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)抑制RP11-350G8.5的表達(dá)可以顯著降低MM細(xì)胞的增殖能力，增加細(xì)胞凋亡率。這一發(fā)現(xiàn)表明，RP11-350G8.5不僅對MM細(xì)胞的生存至關(guān)重要，而且可能通過調(diào)控關(guān)鍵生存信號(hào)通路影響腫瘤的耐藥性。同樣，LINC00467的過表達(dá)也與細(xì)胞存活相關(guān)，且其在MM細(xì)胞中的功能亟待進(jìn)一步研究。此外，他們還考慮了這兩個(gè)lncRNA在不同腫瘤微環(huán)境中的作用，尤其是在與骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）相互作用時(shí)的影響。BMSCs能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供保護(hù)性信號(hào)，而RP11-350G8.5和LINC00467的表達(dá)水平可能影響這一相互作用，進(jìn)一步影響MM的耐藥性和細(xì)胞存活。這兩種lncRNA的相互作用和功能特點(diǎn)為治療MM提供了新的視角，特別是針對這些lncRNA開發(fā)靶向療法，可能會(huì)產(chǎn)生顯著的臨床療效。研究團(tuán)隊(duì)還在考慮利用基因編輯技術(shù)驗(yàn)證這些lncRNA在不同MM細(xì)胞系中的特異功能，從而為后續(xù)的臨床應(yīng)用提供理論支持。
圖5RP11-350G8.5敲除（KO）后ABZB細(xì)胞系的差異表達(dá)和通路富集分析
總體來說，本研究通過對長非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行CRISPR-Cas9篩選，揭示了RP11-350G8.5和LINC00467在多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞中的重要作用。這兩個(gè)lncRNA的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖及對Bortezomib（BZB）耐藥性密切相關(guān)。研究表明，RP11-350G8.5的高表達(dá)與MM患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，且抑制其表達(dá)可顯著降低細(xì)胞增殖能力，增加細(xì)胞凋亡。此外，LINC00467的高表達(dá)也與細(xì)胞存活密切相關(guān)，說明其在腫瘤進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用。研究顯示，這兩個(gè)lncRNA可能在多發(fā)性骨髓瘤（MM）的發(fā)生和發(fā)展中具有協(xié)同效應(yīng)。未來的研究應(yīng)致力于深入探究這兩個(gè)lncRNA的功能機(jī)制，并評估它們在MM治療中的潛力，特別是如何通過靶向這些lncRNA來克服耐藥性。此外，通過結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)可以為個(gè)體化治療提供新的策略，以改善MM患者的治療效果和生活質(zhì)量。
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